Microscopía más allá del límite de resolución

El equipo polaco-israelí de la Facultad de Física de la Universidad de Varsovia y el Instituto de Ciencias Weizmann ha logrado otro logro significativo en microscopía fluorescente. El equipo presentó un nuevo método de microscopía que, en teoría, no tiene límite de resolución. En la práctica, el equipo logró demostrar una mejora cuádruple sobre el límite de difracción.

Imagen de microtúbulos en una muestra de células fijas. Un escaneo confocal de 3 μm x 3 μm de microtúbulos en una célula 3T3 fija marcada con puntos cuánticos analizados de dos maneras. Arriba a la izquierda: microscopía de barrido de imágenes (ISM), abajo a la derecha: microscopía de barrido de imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFISM) después de la reponderación de Fourier. (Fuente: UW Physics, A. Makowski). Crédito: UW Physics, A. Makowski

El continuo desarrollo de las ciencias biológicas y la medicina requiere la capacidad de examinar objetos cada vez más pequeños. Los científicos necesitan ver la estructura y las relaciones mutuas entre, por ejemplo, las proteínas en las células. Al mismo tiempo, las muestras que se observan no deben diferir de las estructuras que ocurren naturalmente en los organismos biológicos, lo que excluye el uso de procedimientos y reactivos agresivos.


Aunque revolucionó las ciencias naturales, el microscopio óptico clásico es claramente insuficiente en la actualidad. Debido a la naturaleza ondulatoria de la luz, un microscopio óptico no permite obtener imágenes de estructuras de menos de 250 nanómetros. Como resultado, los objetos más cercanos entre sí que la mitad de la longitud de onda de la luz (que es aproximadamente 250 nm para la luz verde) no se pueden discernir. Este fenómeno, conocido como límite de difracción, uno de los principales obstáculos en la observación de las estructuras biológicas más pequeñas, los científicos han intentado superarlo durante mucho tiempo.


Los microscopios electrónicos proporcionan una mejor resolución en órdenes de magnitud, pero solo permiten el examen de objetos inanimados, que deben colocarse en el vacío y bombardearse con un haz de electrones. Por esta razón, la microscopía electrónica no se puede utilizar para estudiar organismos vivos y los procesos naturales que ocurren en ellos. Aquí es donde interviene la microscopía de fluorescencia, de ahí el rápido desarrollo de la microscopía de fluorescencia de superresolución como campo de las ciencias físicas y los dos premios Nobel ya otorgados por investigaciones relacionadas, en 2008 y 2014.


Actualmente se encuentran disponibles varias técnicas de microscopía de fluorescencia, y algunas de ellas se han generalizado en la obtención de imágenes biológicas. Algunos métodos, como la microscopía PALM, STORM o STED, se caracterizan por una resolución ultra alta y permiten discernir objetos ubicados a solo una docena de nanómetros entre sí. Sin embargo, estas técnicas requieren largos tiempos de exposición y un complejo procedimiento de preparación de muestras biológicas. Otras técnicas, como la microscopía SIM o ISM, son fáciles de usar, pero ofrecen una mejora de resolución muy limitada, permitiendo identificar estructuras solo la mitad del tamaño del límite de difracción.


Aleksandra Środa, Adrian Makowski y el Dr. Radek Łapkiewicz del Laboratorio de Óptica Cuántica de la Facultad de Física de la Universidad de Varsovia, en cooperación con el Dr. Ron Tenne, Uri Rossman, Gur Lubin y el Prof.Dan Oron del Instituto de Ciencias Weizmann en Israel, han introducido una nueva técnica de microscopía de superresolución, llamada microscopía de barrido de imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFISM).


En SOFISM, las fluctuaciones naturales en la intensidad de emisión de los marcadores fluorescentes se utilizan para mejorar aún más la resolución espacial de un microscopio de barrido de imágenes (ISM). ISM, un método emergente de superresolución, ya se ha implementado en productos comerciales y ha demostrado ser valioso para la comunidad de bioimágenes. En gran parte, dado que logra una modesta mejora en la resolución lateral (x2), con muy pocos cambios en la configuración óptica y sin la desventaja común de los tiempos de exposición prolongados. Por lo tanto, permite una extensión natural de las capacidades de un microscopio confocal estándar. ISM utiliza un microscopio confocal en el que se reemplaza un solo detector por una matriz de detectores.


En SOFISM se calculan las correlaciones de intensidades detectadas por múltiples detectores. En principio, la medición de la correlación de n-ésimo orden puede conducir a un factor de mejora de resolución de 2n con respecto al límite de difracción. En la práctica, la resolución alcanzable para las correlaciones de orden superior está limitada por la relación señal/ruido de las mediciones. ISM utiliza un microscopio confocal en el que se reemplaza un solo detector por una matriz de detectores.


“SOFISM es un compromiso entre facilidad de uso y resolución. Creemos que nuestro método llenará el nicho entre las técnicas complejas y difíciles de usar que proporcionan una resolución muy alta y los métodos fáciles de usar de baja resolución. El SOFISM no tiene un límite de resolución teórico, y en nuestro artículo demostramos resultados cuatro veces mejores que el límite de difracción. También demostramos que el método SOFISM tiene un alto potencial en la obtención de imágenes de estructuras biológicas tridimensionales ”, dijo el Dr. Radek Łapkiewicz.


Fundamentalmente, SOFISM es, en sus aspectos técnicos, altamente accesible, ya que solo requiere introducir una pequeña modificación en el microscopio confocal ampliamente utilizado: reemplazar su tubo fotomultiplicador con un detector de matriz SPAD. Además, es necesario aumentar ligeramente el tiempo de medición y cambiar el procedimiento de procesamiento de datos. “Hasta hace poco, los detectores de matriz SPAD eran costosos y sus especificaciones no eran suficientes para la microscopía basada en correlación. Esta situación ha cambiado recientemente. Los nuevos detectores SPAD introducidos el año pasado eliminaron las barreras tecnológicas y relacionadas con los precios. Esto nos hace pensar que las técnicas de microscopía de fluorescencia como el SOFISM podrían, en unos pocos años, ser ampliamente utilizadas en el campo del examen microscópico ”, enfatizó el Dr. Łapkiewicz.




 

Mas información: Aleksandra Sroda et al, SOFISM: Super-resolution optical fluctuation image scanning microscopy, Optica (2020). DOI: 10.1364/OPTICA.399600

 

Nota original: University of Warsaw, Department of physics

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